人 MAS 相关 G 蛋白偶联受体成员 X2（MRGPRX2）

ELISA 检测试剂盒说明书 

所有试剂在 2°C-8°C 下储存！

 包装尺寸：96T/套，48T/套 

有效期：六个月（2°C-8°C）

 仅供体外研究使用！ 不可用于治疗或诊断应用！

 1. 介绍 

        该双抗夹心 ELISA 试剂盒仅供体外研究使用，不适用于药物、家庭、治疗 或诊断应用！该试剂盒旨在用于测定未稀释的原始人体血清、血浆、人体体液、 组织匀浆、人源细胞样本中 MRGPRX2 蛋白的浓度。

 2. 特性

 灵敏度：该试剂盒的灵敏度为 3.125 ng/ml。

 检测范围：本试剂盒检测范围为 3.125 ng/ml - 250 ng/ml。

 特异性：未观察到该分析物和类似物之间存在显着的交叉反应或干扰。

 重现性：批内 CV (%) 和批间 CV (%) 均小于 15%。[CV(%) = SD/平均值×100]。

3. 试剂盒组成 

1) 酶标包被板 8 孔×12 条                                                           7) 显色液 B 6ml×1 瓶 

2) 标准品（0.25 μg/ml） 0.15ml×1 瓶                                        8) 终止液 6ml×1 瓶

3) 样品稀释液 10ml×1 瓶                                                            9) 封板膜 两张

4)HRP-结合试剂 6ml×1 瓶                                                        10) 密封袋 1 个 

5) 20×洗涤液 25ml 11 说明书 1 份 

6) 显色液 A 6ml×1 瓶

4. 需要但未提供的材料

 1）蒸馏水或去离子水。 2）滤纸。 3）移液器。 4）能够测量 450 nm 吸光度的酶标仪。 5）恒温培养箱，可提供高达 37°C±0.5°C 的稳定培养条件。

5. 样品收集和储存 

1）血清-将促凝血 30 分钟内以 1000 × g（或 3000 rpm）离心约 20 分钟。小心 吸取上清液，立即测定或将样品储存在 -20°C 或 -80°C。避免反复冻融。

2）血浆-使用 EDTA 或肝素作为抗凝剂收集血浆。30 分钟内将抗凝血以 1000 × g（或 3000 rpm）离心约 20 分钟。小心收集上清液，立即检测或将样品储存在 -20°C 或 -80°C。避免反复冻融。 

3）血液-使用 EDTA 或肝素作为抗凝剂收集血液。将样品 30 分钟内以 1500 g × 离 心约 15 分钟（或 5000 rpm）。小心收集上清液，立即检测或将样品储存在 -20°C 或-80°C。避免反复冻融。 

4）组织匀浆-组织匀浆的制备将因组织类型而异。去除多余的血液和均质前称重。 将组织切成小块并在一定量的 PBS（通常为 10mg 组织至 100μl PBS）。之后， 以 1500×g（或 5000 rpm）的速度离心匀浆约 15 分钟。小心吸取上清液，立即 测定或将样品储存在 -20°C 或 -80°C。避免反复冻存。 

5）细胞-将细胞以 1000 × g（或 3000 rpm）收集后。小心收集细胞沉淀，立即检 测或将样品储存在 -20°C 或 -80°C。避免反复冻融。

重要说明：

    虽然我们列出了大部分可能的样本，但这并不意味着所有这些列出的样本中 都存在分析物，因为有些分析物只存在于某些特定的细胞器、细胞或组织中。 我们只对试剂盒本身负责，不对检测过程中消耗的样品负责。用户应计算整个测 试中使用的样品的可能数量。请确保有足够的样品可用。 推荐使用未经长期保存的新鲜样品进行检测。否则，蛋白质降解和变性可能 会出现在这些样本中并最终导致错误的结果。5 天内使用的样品可以在 2-8°C 下 储存，否则样品必须在-20°C（≤ 1 个月）或-80°C（≤ 2 个月）下保存，以避免 生物活性损失和污染。避免反复冻融。 严重溶血的样品不适合用于本试验，因此样品应充分离心，不得允许溶血或 颗粒物。 本试剂盒不能测定含有叠氮化钠（NaN3）的样品，因为 NaN3会抑制辣根过 氧化物酶（HRP）的活性。 若样品未在说明书中注明，则需进行初步实验以确定本试剂盒的有效性。

6. 试剂制备和储存 

1）本试剂盒在 2°C-8°C 下的有效期为六个月。该试剂盒不应在过期日期后使用。

2）洗涤液 (1×) - 用 19 倍体积的去离子水或蒸馏水稀释一体积的洗涤液 (20×)。 稀洗涤液在 2°C-8°C 下可稳定 1个月。未稀释的洗涤液和其他试剂在 2°C-8°C 下 可稳定 6 个月。 

3）标准品的稀释：加 150ul 样品稀释液到标准品管中，然后漩涡混匀 30 秒，充 分溶解，避免气泡，即为标准品原液（24 小时内用完）。取 5 支干净的 Eppendorf 管，每管加 150μl 的样品稀释液，分别标记上 125ng/ml，62.5ng/ml，31.25ng/ml， 15.625ng/ml，7.80 ng/ml，0ng/ml。取 150μl 标准品原液（250ng/ml）加入标记 125ng/ml 的管中，混匀后同样取出 150μl，加入下一管，以此类推直至最后一管。 零孔：直接加样品稀释液。

4）当试剂盒打开时，从铝箔袋中取出板后，请尽快用完所有板条。板条是可拆 卸的，因此请将未使用的孔放回装有干燥剂包的铝箔袋中，然后重新密封沿拉链 密封的整个边缘以防止受潮。其余试剂仍需在 2°C-8°C 下保存。 

7. 操作步骤 

实验前请检查所有试剂和设备，确保一切正常！ 请严格按照化验程序进行实验，切勿随意更改任何化验程序！ 

1）在开始检测之前，将所有试剂和样品自然置于室温 (18°C-25°C) 30 分钟。酶 标板条是可拆卸的，从板框架上拆下未使用的条带，将它们与干燥剂包一起放回 铝箔袋中，并重新密封以防止受潮。 

2）设置标准蛋白孔、样品孔和空白对照孔，每个标准孔加用样品稀释液配好的 标准蛋白 100μl，样品孔加用样品稀释液溶解的样品 100μl。盖上封闭板膜，37°C 孵育 60 分钟。 

3）洗板 4 次。将孔中的培养混合物倒入水槽或适当的废物容器中。使用移液器 用洗涤液 (1×) 将每个孔完全填满，静置约一分钟后，倒转并撞击板到吸收剂上 纸或纸巾，直到没有水分出现。重复此过程四次。

4）每孔加入 100μl HRP 结合试剂，盖上封闭板膜，37°C 孵育 60 分钟。 

5）洗板 4 次。将孔中的培养混合物倒入水槽或适当的废物容器中。使用移液器 用洗涤液(1×)将每个孔完全填满，静置约一分钟后，倒转并撞击板到吸收剂上纸 或纸巾，直到没有水分出现。重复此过程四次。 

6）每孔依次加入显色液 A 50 μl 和显色液 B 50 μl。然后避光保护在 37°C 下孵育 15 分钟。 

7）每孔加入 50μl 终止液。孔中的颜色应从蓝色变为黄色。 

8）在加入终止溶液后 15 分钟内使用酶标仪读取 450 nm 处的光密度 (O.D.)（约 5 分钟是最好的时间）。 

9）重要说明 

（1）在储存和孵育过程中使所有试剂免受强光照射。所有试剂瓶盖要盖紧防止 微生物的蒸发和污染。 

（2）除非需要，否则不要从铝箔袋中取出酶标板。酶标板第一次打开时，孔中 可能有一些雾状物质，它不会对最终检测结果产生任何影响。 

（3）本试剂盒标准品的浓度梯度已经涵盖了远远超过本试剂盒的浓度范围。 

（4）检测样本时，请使用未稀释的原始样品中的分析物，因此在使用我们的试 剂盒时请直接分析未稀释的原始样品，否则裂解缓冲液制备的样品可能会导致不 可靠的结果，此外，这种被稀释的分析物的水平可能超出试剂盒的检测范围。 

（5）样品稀释液还含有少量稳定剂和防腐剂。它是作为一个空白的很好试剂（调 零值），所以请勿使用您自己的 PBS 或其他试剂作为空白/对照。

 （6）样品或试剂添加：请小心地将样品添加到孔中并轻轻混合以避免起泡。对 于程序中的每个步骤，将试剂或样品添加到检测板的总时间应为不超过 10 分钟。为避免污染，请在每次转移时使用新鲜的一次性移液器吸头。 

（7）孵育：为确保准确的结果，在孵育步骤中酶标板需密封。必须遵守孵育时 间和温度。孵育时不要摇晃，因为摇晃不均匀会影响抗原与抗体的结合反应。 

（8）洗涤板：洗涤程序很关键。每一步完全去除液体对于良好的性能至关重要。 最后一次洗涤后，通过抽吸去除任何剩余的洗涤液，洗涤不充分会导致精度差和 吸光度读数错误升高。 

（9）反应时间的控制：加入底物后观察颜色的变化（如每 10 分钟观察一次）。 孔中出现的颜色将从蓝色变黄色。如果颜色变为绿色，则表明终止液没有完全混 合。 

（10）显色液 B 易被污染，加入酶标板前应保持无色或淡蓝色，请注意避光。

8.结果的计算 

1）校准值是每个标准和样品的平均值减去空白(VB) 的平均光密度。根据浓度和 OD 值算出标准曲线的回归方程，建议用专用计算软件进行计算，标曲示意图如 下：

2）使用专业的曲线拟合软件制作标准曲线（一般曲线大部分是线性的，少数曲 线是二次或三次）并计算该分析物的水平。 

3）注意：环境温度、设备、操作、移液、洗涤、孵育温度或时间以及试剂盒的 任何变化会导致结果的变化。每个试剂盒都应该获得相应标准曲线。